Питательные среды для культивирования растительных эксплантов in vitro

В XIX в. появились основы развития органической химии. Были открыты многие органические кислоты, глицерин, холестерин, глюкоза, первые аминокислоты, осуществлен синтез мочевины. Для зарождения энзимологии большое значение имело изучение процесса гидролиза полисахаридов.

Благодаря трудам французского химика и микробиолога Л. Пастера в конце XIX в. были созданы условия для дальнейшего развития прикладной (технической) микробиологии, а также в значительной мере и биотехнологии. В 1859 г. Луи Пастер приготовил стерильную жидкую питательную среду и поместил ее в колбу с S-образным горлышком. Обычный воздух свободно поступал в колбу, но микроорганизмы оседали на стенках и не достигали питательной среды. При помощи такого остроумного опыта Л. Пастер доказал невозможность самозарождения жизни ив 1862 г. получил за это премию от Французской академии наук. Пастер установил также, что микроорганизмы играют ключевую роль в процессах брожения, и показал, что в образовании отдельных продуктов участвуют разные их виды.

Крупным достижением данного периода была разработка метода чистых культур, а также усовершенствование сред для выделения и выращивания микроорганизмов.

Немецкий микробиолог Роберт Кох в 1876 г. вырастил бациллы сибирской язвы в капле водянистой влаги, извлеченной из глаза погибшей коровы. В 80-е гг. XIX в. Р. Кох предложил метод культивирования бактерий на стерильных ломтиках картофеля, а позднее — на агаризованных питательных средах. Как следствие этого, удалось доказать индивидуальность микроорганизмов и получить их в чистых культурах. Более того, каждый вид мог быть размножен на питательных средах и использован в целях воспроизведения соответствующих процессов (бродильных, окислительных и др.), например, маслянокислые бактерии и вызываемое ими маслянокислое брожение, лактобактерии и молочнокислое брожение, дрожжи-сахаромицеты и спиртовое брожение, уксуснокислые бактерии и окисление этанола до уксусной кислоты и т.д.

К настоящему времени разработаны различные прописи питательных сред, состав которых зависит от вида растения, типа экспланта, задач культивирования. Наиболее широко применяются среды Мура-сига — Скуга (МС), Уайта, Гамборга (В5) и некоторые др.

Наиболее часто используется питательная среда по прописи Мура-сига и Скута, разработанная в 1962 г. физиологами растений. Сегодня среда МС считается универсальной для культивирования большинства видов растений, так как она хорошо сбалансирована по химическому составу и обеспечивает хорошие показатели при введении объектов в культуру in vitro (табл. 3.2). Питательная среда МС пригодна для индукции каллусо- и морфогенеза у большинства двудольных растений.

Таблица 3.2

Состав питательной среды по прописи Мурасига и Скута для культивирования изолированных тканей растений

Компоненты питательной среды

Концентрация, мг/л

NH4NO3

1650

KNO3

1900

СаС12-2Н2О

440

MgSO4-7H2O

370

КН2РО4

170

№2ЭДТА

37,3

FeSO4-7H2O

27,95

Н3ВО3

6,2

MnSO4- 4Н2О

22,3

ZnSO4-7H2O

8,6

0,83

Na2MoO4-2H2O

0,25

CuSO4-5H2O

0,025

CoC12-6H2O

0,025

Глицин

2,0

Мезоинозит

100

Никотиновая кислота

0,5

Пиридоксин — НС1

0,5

Тиамин — НС1

1,0

Сахароза

30 000

Не менее популярна среда Гамборга (В5) (табл. 3.3), составленная в 1968 г. для культуры каллуса сои. Среда В5 содержит гораздо больше нитратов по сравнению с ионами аммония. Сегодня среда Гамборга применяется для культивирования бобовых и злаковых растений.

Состав питательной среды Гамборга (В5) для культивирования изолированных тканей растений

Компоненты питательной среды

Концентрация, мг/л

NH4NO3

2500

СаС12-2Н2О

150

MgSO4-7H2O

250

(NH4)2SO4

130

№2ЭДТА

37,3

FeSO4-7H2O

27,95

NaH2PO4H2O

150

H3BO3

3,0

MnSO4- 4H2O

10,0

ZnSO4-7H2O

2,0

0,75

Na2MoO4-2H2O

0,25

CuSO4-5H2O

0,025

CoC12-6H2O

0,025

Мезоинозит

100

Никотиновая кислота

1,0

Пиридоксин — НС1

1,0

Тиамин — НС1

10,0

Сахароза

30 000

Среда Уайта (табл. 3.4) считается бедной средой по содержанию макро- и микроэлементов. Ее наиболее часто применяют при клональном микроразмножении растений на двух этапах:

1) на этапе собственно микроразмножения, когда необходимо добиться быстрого роста побегов после регенерации;
2) на этапе укоренения, позволяющем увеличить выход укоренившихся микропобегов и снизить вероятность формирования кал-лусной ткани в базальной части побега (черенка).

Питательную среду Нича (табл. 3.5) рекомендуется использовать в работах по получению гаплоидных растений, при культивировании изолированных пыльников, например, злаковых культур в условиях in vitro. На данной питательной среде наблюдается индукция образования зародышеподобных структур, из которых в дальнейшем формируются проростки.

Состав питательной среды Уайта для культивирования изолированных тканей растений

Компоненты питательной среды

Концентрация, мг/л

Na2SO4

200

Ca(NO3)2

200

KN О3

КС1

MgSO4-7H2O

360

KH2PO4

16.5

№2ЭДТА

37.3

FeSO4-7H2O

27.95

H3BO3

1.5

MnSO4- 4H2O

4.5

ZnSO4-7H2O

1.5

0.75

Fe2(SO4)3

2.5

Na2MoO4-2H2O

0.0025

CuSO4-5H2O

0.02

Глицин

3.0

Мезоинозит

Никотиновая кислота

0.5

Пиридоксин — НС1

0.1

Тиамин — НС1

0.1

Сахароза

20 000

Таблица 3.5

Состав питательной среды Нича для культивирования изолированных тканей растений

Компоненты питательной среды

Концентрация, мг/л

NH4NO3

720

KNO3

950

MgSO4-7H2O

185

СаС12Н2О

166

КН2РО4

№2ЭДТА

37.3

Компоненты питательной среды

Концентрация, мг/л

FeSO4-7H2O

27,8

Н3ВО3

MnSO4-4H2O

ZnSO4-7H2O

Na2MoO4-2H2O

0,25

CuSO4-5H2O

0,025

Мезоинозит

200

Аскорбиновая кислота

Пиридоксин — НС1

Тиамин — НС1

Сахароза

60 000

Среда WPM (от англ.: Woody Plant Medium) (табл. 3.6) применяется для культивирования древесных растений, таких как лесные лиственные и хвойные породы. Отличительной особенностью данной среды является то, что ионы кальция входят в состав среды в виде соли Ca(NO3)2 и СаС12 в отличие от предыдущих сред. Именно Ca(NO3)2 оказывает непосредственно положительное влияние на формирование мощных побегов за счет формирования клеток с плотной клеточной стенкой. К тому же в составе среды WPM макро- и микроэлементы находятся в невысоких концентрациях.

Таблица 3.6

Состав питательной среды WPN для культивирования изолированных тканей растений

Компоненты питательной среды

Концентрация, мг/л

Ca(NO3)2 4Н2О

556

NH4NO3

400

СаС12-2Н2О

MgSO4-7H2O

370

КН2РО4

170

K2SO4

990

№2ЭДТА

37,3

FeSO4-7H2O

27,8

ZnSO4-7H2O

8,6

CuSO4-5H2O

0,25

Компоненты питательной среды

Концентрация, мг/л

Глицин

2,0

Мезоинозит

100

Никотиновая кислота

0,5

Пиридоксин — НС1

0,5

Тиамин — НС1

0,5

Сахароза

20 000

Питательная среда Кворина — Лепуавра (QL) (табл. 3.7) применяется для культивирования in vitro изолированных тканей и органов плодово-ягодных культур, таких как яблоня, груша, малина, ежевика, виноград, жимолость, слива, актинидия и др.

Таблица 3.7

Состав питательной среды Кворина — Лепуавра для культивирования изолированных тканей растений

Компоненты питательной среды

Концентрация, мг/л

Ca(NO3)24H2O

833,8

NH4NO3

400

KNO3

1800

MgSO4-7H2O

0,76

КН2РО4

270

№2ЭДТА

37,3

FeSO4-7H2O

27,8

Н3ВО3

6,2

MnSO4- 4Н2О

0,76

ZnSO4-7H2O

8,6

0,08

Na2MoO4-2H2O

0,25

CuSO4-5H2O

0,025

CoC12-6H2O

0,025

Глицин

2,0

Мезоинозит

100

Никотиновая кислота

0,5

Пиридоксин — НС1

0,5

Тиамин — НС1

0,5

Сахароза

30 000

Однако различные питательные среды для культуры клеток растений имеют много общего. Они должны включать все необходимые минеральные и органические элементы в концентрациях, максимально приближенных к тем, которые получают интактные растения для нормального роста и развития в почвенных условиях. Основные прописи питательных сред приведены в приложениях 1 и 2.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎